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    酶聯(lián)免疫法測定大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)殘留量

    點擊次數(shù):1039  更新時間:2017-03-21

    (1)費氏弧菌發(fā)光桿菌包被液(P H9.6碳酸鹽緩沖液) 稱取碳酸鈉0.32g、碳酸氫鈉0 .5 8 6 g ,置200ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度。
    (2 )磷酸鹽緩沖液(p H 7 . 4 )稱取氯化鈉8g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g,加水溶解并稀釋至500ml, 121°C滅菌15分鐘。
    (3 )洗滌液(pH7.4) 量取聚山梨酯20 0.5ml,加磷酸鹽緩沖液至500ml。
    (4 )稀釋液(p H 7 . 4 )稱取牛血清白蛋白0.5g,加洗滌液溶解并稀釋至100ml。
    (5 )濃稀釋液稱取牛血清白蛋白l.O g , 加洗滌液溶解并稀釋至100ml。
    (6 )底物緩沖液(pH 5 .0枸櫞酸-磷酸鹽緩沖液) 稱取磷酸氫二鈉(Na2HP04 . 12H20 )1 . 84g、枸櫞酸 0. 51g,加水溶解并稀釋至100ml。
    (7 )底物液取鄰苯二胺8mg、30%過氧化氫30^1,溶于底物緩沖液20ml中。臨用時現(xiàn)配。
    (8 )終止液lm o l/L硫酸溶液。
    費氏弧菌發(fā)光桿菌標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備  按菌體蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品說明書加水復(fù)溶,精密量取適量,用稀釋液稀釋成每lm l中含菌體蛋白質(zhì)500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng的溶液。
    供試品溶液的制備  取供試品適量,用稀釋液稀釋成每l m l中約含2 5 0 ug 的溶液。如供試品每l m l中含量小于500ug時,用濃稀釋液稀釋1倍。
    測定法 取兔抗大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)抗體適量,用包被液溶解并稀釋成每lm l中含10ug 的溶液,以100ul/ 孔加至9 6孔酶標(biāo)板內(nèi),4 °C放置(16~1 8小時)。用洗滌液洗板3次;用洗滌液制備1%牛血清白蛋白溶液,以200u1/孔加至酶標(biāo)板內(nèi),37°C放置2 小時;將封閉好的酶標(biāo)板用洗滌液洗板3 次;以100u1/孔加人標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液,每個稀釋度做雙孔,同時加入2 孔空白對照(稀釋液),37°C放置2 小時;用稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)抗體1000倍,以100u1/ 孔加至酶標(biāo)板內(nèi),37°C放置1 小時,用洗滌液洗板1 0次,以l00ul/孔加人底物液,3 7 °C避光放置4 0 分鐘,以5 0 p l /孔加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在波長4 9 2 n m 處測定吸光度,應(yīng)用計算機(jī)分析軟件進(jìn)行讀數(shù)和數(shù)據(jù)分析,也可使用手工作圖法計算。
    以標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度對其相應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并以供試品溶液吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到相應(yīng)菌體蛋白質(zhì)含量,
    按以下公式計算:
    供試品費氏弧菌發(fā)光桿菌菌體蛋白質(zhì)殘留量(%) = (c×n)/(T×106)×100
    式中 c為供試品溶液中菌體蛋白質(zhì)含量,ng/ml;
         n為供試品稀釋倍數(shù);
         T為供試品蛋白質(zhì)含量,mg/ml。

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