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    豬等孢球蟲通用PCR檢測試劑盒反應(yīng)五要素

    點(diǎn)擊次數(shù):865  更新時(shí)間:2021-03-16

    豬等孢球蟲通用PCR檢測試劑盒反應(yīng)五要素:

    參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

    引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:

    ①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。

    ②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

    ③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

    ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

    ⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

    性能:
    1. 準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,大于等于0.9900。
    2. 靈敏度:檢測濃度小于0.1 U/mL。
    3. 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
    4. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
    5. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
    6. 有效期:6個(gè)月

    ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn), 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

    ⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

    引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

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